Notch1诱导的小鼠白血病环境对正常造血干祖细胞作用机制的研究

【摘要】目的：白血病是造血系统的恶性肿瘤,其特点是骨髓及其它造血组织中正常血细胞生成减少,白血病细胞进行性异常增生、浸润并损害各种组织、器官,并进入外周血液,使外周血白细胞发生质和量的异常。白血病临床表现主要有贫血,出血,发热,感染。白血病的病因复杂,病毒因素、化学因素、放射因素、遗传因素都在白血病的发生发展中起重要作用。目前对于白血病的研究主要集中在白血病细胞,但是对于白血病环境下残余的正常造血干细胞(HSC)的功能变化及其机制还没有深入研究。本课题以急性T淋巴细胞白血病为模型,研究白血病宿主体内残留的正常造血细胞功能变化的相关机理。方法：1.将过表达Notch1胞内结构域(ICN1)的逆转录病毒载体MSCV-ICN1-IRES-GFP感染C57BL/6小鼠骨髓LinScal+细胞(CD45.2)。实验组将106过表达ICN1-GFP的白血病细胞与107B6.SJL鼠(CD45.1)骨髓有核细胞尾静脉注入到9.5Gy照射后的C57BL/6受体小鼠,建立白血病小鼠模型。对照组以108C57BL/6小鼠的骨髓细胞替代白血病细胞。移植后流式细胞术检测外周血、骨髓中正常造血细胞和白血病细胞比例,H.E.染色检测白血病细胞在各种组织中的浸润。并在建模后第三天利用BrdU分析正常HPC(Lin-c-Kit+Scal-)处于S期的比例。第十天应用Hoechest/PY分析正常HSC(Lin-c-Kit+Scal+)处于G0/G1期的比例。2.建模后第十天,分选白血病环境下的正常HSC,送做基因芯片。并通过RealtimeRT-PCR对芯片结果中的相关基因进行验证,尤其是Hes1基因在白血病环境下正常HSC、HPC中的表达差异以及和对照组HSC、HPC的表达差异。3.构建Hes1过表达的逆转录病毒载体MSCV-Hesl-IRES-GFP,包装293T,病毒上清感染B6小鼠Lin-细胞,将5×104Hes1-GFP+细胞与106白血病细胞共同移植入致死剂量照射后的C57鼠,并注入107CD45.1+Lin+细胞作为保护细胞,构建骨髓Lin-细胞过表达Hes1的小鼠白血病模型。对照组使用空载体MSCV-IRES-GFP感染B6鼠Lin-细胞后,以相同数量与白血病细胞、保护细胞共同植入照射后的受体鼠。4.分选Hes1感染后的GFP+细胞做CFU。Hes.1过表达模型建模后第十天,应用流式分析骨髓中Hes1+in-造血细胞及Hes1+SPC的植入率。5.在T-ALL白血病小鼠模型移植后第十天,ELISA测外周血血清和骨髓中分泌型SCF的浓度,westernblot检测骨髓细胞SCF的表达量。并用RealtimePCR睑测外周血细胞,脾细胞,骨髓细胞及骨髓中白血病细胞和正常造血细胞SCF表达水平。统计学分析：计量资料比较采用student’sttest,计数资料比较采用Χ2test。最大似然法采用统计软件L-CalcTM分析,生存资料采用Prism4.0软件分析。结果：100%白血病组小鼠在3周内发白血病,中位生存时间13天。10天后,发病小鼠肝、脾肿大,13天时外周血和骨髓细胞白血病细胞(GFP+细胞)占90%以上,CD4+CD8+细胞占80%左右,正常造血干祖细胞频率及绝对数下降。细胞周期分析发现在发病早期HPC增殖加快,发病晚期HSC大多处于静止期。芯片结果显示HSC中与细胞周期,增殖,归巢,粘附相关的许多基因表达发生改变,Hes1在白血病环境下正常HSC中的表达升高,但在HPC中的表达无明显差异。过表达Hes1的体外功能试验结果显示Hes1过表达造血祖细胞CFU形成能力显著下降。过表达Hes1的体内功能试验结果显示Hesl+Lin-细胞及Hesl+HSPC在骨髓中的植入率升高。白血病小鼠SCF蛋白表达水平比对照组高,但RealtimePCR结果显示在外周血、脾、骨髓等白血病细胞占大多数的组织中,白血病小鼠SCF的RNA水平明显低于对照,从骨髓分选的白血病细胞,其SCF的RNA表达水平也低于对照。与此相反,骨髓中的正常造血细胞SCF表达水平是对照小鼠的4.52倍。结论：1.基因芯片结果显示在白血病环境下,正常HSC中与细胞增殖,粘附,归巢相关的基因如CXCR4,Mmp2,Itgb3,Hes1,p21表达改变,使HSC处于更稳定的周期状态中。2.Hes1在白血病中HSC和HPC的差异表达提示HSC和HPC中Hes1对白血病环境的不同反应造成造血干祖细胞的不同命运。3.体外实验显示Hes1对HPC的细胞周期有抑制作用,体内试验也说明Hes1过表达对于白血病环境下造血干祖细胞数量的维持有一定的保护作用,提示Hes1高表达是白血病环境下正常造血干细胞功能可逆性受抑的机制之一。4.在T-ALL白血病环境下,外周血和骨髓中SCF的蛋白表达升高,但白血病细胞SCFmRNA量低于对照,正常细胞反而升高,提示SCF是非白血病细胞对白血病环境的一种反应而分泌的。
【作者】田晨；
【导师】程涛；
【作者基本信息】北京协和医学院，细胞生物学，2011，博士
【关键词】造血干细胞；造血祖细胞；急性T淋巴细胞白血病；SCF；Hesl；保护；细胞周期；

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